Indhold
- Påvisning ved brug af farveændringer
- Brug af en ELISA-læser til måling
- Direkte konkurrencedygtig ELISA (cytochrom c)
- Inkuber det primære antistof i rør
ELISA-testen er et enzymbundet immunosorbentassay, der anvender antistoffer eller antigener koblet til et specifikt enzym for at bestemme koncentrationen af antistof eller antigen. Hvis du tager en ELISA og ikke kan bruge specifikke antistoffer til at opnå dine resultater, foreslås konkurrencedygtig ELISA, fordi den bruger et antigen, der er konjugeret til et enzym i stedet for antistoffet og en anden påvisningsmetode.
Påvisning ved brug af farveændringer
En fælles protokol for den konkurrencedygtige ELISA er at anvende et umærket og oprenset primært antistof. Antistoffet belægger brøndene i en mikrotiterplade og inkuberes med ukendte standarder. Et immunogen tilsættes derefter til konjugat med det primære antistof, hvilket vil binde til antistofstederne, der endnu ikke er optaget. Et substrat bruges derefter til at skabe en farveændring for at måle bindende koncentration.
Brug af en ELISA-læser til måling
Brug en mikrotiterpolystyrenplade og tilsæt det primære antistof til hver brønd. For at opnå maksimal binding, fyld brønden med et mikrogram af antistoffet. Inkubér pladen i fire timer ved stuetemperatur. Tilsæt primærfangstantistoffet og vask brøndene med PBS (phosphatpufret saltvand). Inkuber plader med blokeringsbuffer i to timer ved stuetemperatur. Vask brøndene to gange igen med PBS og tilføj standarderne. Anbring antigen-konjugatopløsningen i brøndene og inkuber igen i to timer. Vask pladen igen med PBS fire gange. Tilsæt substratet og måle densiteterne ved den specifikke bølgelængde ved hjælp af en ELISA-læser.
Direkte konkurrencedygtig ELISA (cytochrom c)
For en direkte konkurrencedygtig ELISA skal en serumfortyndingsanalyse for det antigen, du bruger i eksperimentet, udføres. Mikrotiterpladen overtrækkes derefter med cytochrom c og inkuberes natten over. ELISA-delen af assayet udføres derefter ved tilsætning af blokeringsreagens og sekundært antistof. Absorbansresultater læses med en mikropladslæser.
Inkuber det primære antistof i rør
Ved denne fremgangsmåde inkuberes det primære antistof i reagensglas, hvor antigenet af interesse binder sig til det. Prøverne tilsættes derefter til brøndene i mikrotiterpladerne og inkuberes. Brøndene vaskes derefter for at fjerne eventuelle ubundne antigen-antistofkomplekser, og derefter tilsættes blokeringsopløsningen for at forhindre, at det andet antistof binder til brøndene. Det sekundære antistof læses derefter på en pladelæser for at opnå resultaterne.