Indhold
Agarosegelelektroforese er en videnskabelig procedure anvendt i forskning og diagnostiske projekter, der involverer undersøgelsen af nukleinsyrer. Det gør det muligt for forskeren eller teknikeren at adskille de ladede nukleinsyremolekyler, såsom DNA, i overensstemmelse med deres størrelse, og bruges til at analysere de produkter, der genereres af eksperimentet, såsom polymerasekædereaktionen. Det anvendes rutinemæssigt, fordi det er billigt at køre, hurtig proces og muliggør analyse af nukleinsyrenes genopretning.
Gør gelen
Saml alle nødvendige genstande og rens dem med 70% ethanol. Varer omfatter gelstøbt bakke, klæbebånd, agarose i laboratoriekvalitet, kolber eller cylindre, 10x koncentrations- (Tris-Borat-EDTA, TBE) run-buffer, ethidiumbromid, farvestof og prøven, som skal analyseres. Sørg også for at have et gelelektroforese reservoir og strømkilde. Agarose fremstilles ved at veje den passende mængde DNA-tape, som skal analyseres, blande det med TBE-bufferen og smelte i mikrobølgeovnen. Generelt er en 1% til 2% opløsning tilstrækkelig til at dække mange DNA-tråde undersøgt i den daglige molekylærbiologi. Små DNA'er kræver mere koncentrerede geler, mens større kræver mere fortyndede geler. Agaroseopløsningen blandes med ethidiumbromid, som vil binde til nukleinsyren under elektroforeseproceduren. Denne opløsning hældes i gelens smeltebakke, ligesom en støbekom er indsat, og blandingen henstår at størkne.
Indsæt og aktiver gelen
Gelen fjernes fra bakken og nedsænkes i et gelelektroforese reservoir indeholdende løbebuffer. De prøver, der skal analyseres, blandes med farvestoffer og anbringes i brønde i gelen, der skabes af kammen. En markør eller skala indgår også for at tillade efterforskeren at se fremskridtene i elektroforeseen og bestemme størrelsen af de dannede fragmenter. En elektrisk strøm påføres derefter gelen, som tvinger prøven til at migrere fra den ene ende af gelen til den anden. Under denne proces adskilles nucleinsyrerne i prøven i fragmenter af forskellige størrelser, med større molekyler, der kommer tættere på brønden, og mindre molekyler bevæger sig til den anden ende af gelen.
Analyser gelen
Efter afslutning af elektroforeseproceduren fjernes gelen fra reservoiret og anbringes i en UV-transilluminator, som belyser nukleinsyrefragmenterne, som binder til det fluorescerende ethidiumbromid. Et fotografi af dette er gjort, og båndene af nukleinsyrerne kan måles i overensstemmelse med den afstand, som migrerede gennem gelen. Skalaen adskiller dem i bånd af kendte størrelser og kan bruges til at lede forskeren under analysen.