Indhold
Agarosegeler fremstilles af forskere, der arbejder i molekylærbiologilaboratorier for at studere DNA-fragmenter, der modificeres under eksperimentelt arbejde. Teknikken til at lave agarosegel er en grundlæggende rutine færdighed, der skal styres af alle forskere, da det giver mulighed for direkte visualisering af forskellige størrelser af DNA til verifikation og genkloning. Selvom gelbehandling ikke er svært, som med alle laboratorieprocedurer, bør den kun prøves af en professionel, der er videnskabeligt uddannet på grund af de involverede biologiske risici.
retninger
-
Sørg for, at gelbaserne ikke har revner eller noget, der kan medføre, at den varme agarose lækker. Rengør bakker med 70% alkohol og lad det tørre helt. Basen har to åbne ender og to lukkede ender. I nogle formater er der klip forsynet med dem for at lukke enderne, men de fleste skal forsegles ved at placere tape strimler mellem de åbne dele. Tryk båndet fast og sikkert, da de kan bevæge sig væk fra holderen og lade den varme agarose lekke.
-
Baseret på størrelsen af DNA-fragmentet, der skal separeres og analyseres på agarosegel, bestemmes den passende procentdel, der skal bruges. For eksempel ved 1% (vægt / volumen) vil agarosegelen være effektiv til analysen af 0,5 til 10 kb DNA-segmenter. Jo højere procentdelen (mere agarose), desto mindre er fragmenterne, der kan adskilles. Rutinemæssige eksperimenter anvender et område på 0,5% til 2% agarose. Til 1% agarosegel vejer 1 g agarosepulver i en kemisk dressing eller et andet indeslutningssystem. Overfør forsigtigt til gelens laboratorieforberedelsesområde.
-
I det passende gelpreparationsområde måles 100 ml elektroforesebuffer. Det bør være ved stuetemperatur. Overfør agarosepulveret til en brandsikkert kolbe og hæld det målte volumen elektroforesebuffer. Opvarm forsigtigt blandingen i en mikrobølgeovn, men kog den ikke, da fordampning kan ændre procentdelen af agarosen til stede. Sørg for, at al agarose er opløst, ryst til grundigt at blande, lad afkøle lidt, og tilsæt derefter 0,5 mikrogram per milliliter ethidiumbromid. Undgå indånding af damp, da dette kan irritere lungerne og slimhindevævene. Opløs ikke opløsningen efter at ethidiumbromidet er tilsat. Ryst igen for at blande, og derefter, mens opløsningen stadig er varm nok til at blive spildt, dispensere den i den forberedte base. Bemærk, at hvis en stor mængde prøve eller en lille koncentration af DNA er til stede, kan en tykkere gel fremstilles. Imidlertid er de finere geler lettere at analysere, fordi de bliver mere tydeligt fotograferet.
-
Indsæt kammen i gelen for at skabe riller eller brønde for prøven, der skal placeres. Lad det afkøles til stuetemperatur i flere timer eller i køleskabet i et par minutter. I sidstnævnte tilfælde skal gæret af agarosekrystaller, når gelen er klar, overholdes. Generelt forsvinder de, hvis gelen får lov til at opvarme til stuetemperatur på en bordplade i et par minutter før brug. Fjern forsigtigt kamrene for ikke at rive gelen eller bryde brøndene. Agarosegelen er nu klar til brug. Hvis den ikke anvendes straks, skal den pakkes i cellofan eller opbevares i en plastikbeholder i køleskabet for at forhindre, at den tørrer ud eller smelter.
Fremstilling af agarosegelen
advarsel
- De anvendte reagenser er mulige kræftfremkaldende stoffer og skal håndteres med omhu og tilstrækkelig beskyttelse. Hvis der opstår en fejl under fremstillingen af gelen, bør den aldrig genopvarmes, men elimineres og en ny gel fremstilles igen.
Hvad du har brug for
- Agarosepulver til elektroforese
- TAE eller TBE buffer
- Ethidiumbromidopløsning
- Gel Base
- Tape eller gel base klip
- Gel kamme
- Vægte og forbrugsstoffer
- ethanol
- Laboratory Håndklæder
- Personligt beskyttelsesudstyr