Indhold
Lise er et græsk ord og betyder simpelthen "at opdele" eller "at nedbrydes". Det er en god beskrivelse af reaktionen, der opstår med celler i en lysepuffer, en opløsning, der nedbryder dem for at udvinde deres indhold. Forskere bruger disse løsninger til at ekstrahere DNA eller proteiner i celleanalyse, især i tilfælde af bakterier. Typen af cellelyse-buffer varierer afhængigt af typen af eksperiment, men vi vil nævne nogle almindelige valg.
Buffer og salt
Pufferopløsningerne stabiliserer pH, mens cellerne gennemgår lyseringsprocessen. Tris-HCL-opløsningen er den mest almindelige buffer til buffering ved pH 8, hvis pH ønskes. HEPES er en anden almindelig bufferløsning i disse eksperimenter. Natriumchlorid kan også tilsættes for at øge ionstyrken, den samlede koncentration af opløste stoffer uden for cellerne. Sidstnævnte er vigtigt, da vand kan spredes til alle cellemembraner, fra områder med lav koncentration af opløst stof til dem med høj koncentration.
Vaskepulver
Vaskemiddel er den vigtigste ingrediens, der opløser cellemembranen, så indholdet kan slippe ud. Vaskemidler er amfipatiske molekyler, det vil sige med den ene ende, der let interagerer med vandmolekyler, mens den anden hydrofobe ende, eller "der er bange for vand", ikke gør denne interaktion. De kan opløse fedt ved at danne miceller, små grupper, hvor de hydrofobe haler af detergentmolekylerne peger indad mod fedtmolekylerne. Almindelige detergenter er natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 og tritonX.
Chelateringsmidler og hæmmere
Lysepuffere indeholder normalt også chelateringsmidler, såsom ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) eller retylenglycoltetraeddikesyre (EGTA). Disse kemikalier binder sig til metalioner med en +2 ladning (for eksempel magnesium og calcium), hvilket gør dem utilgængelige for andre reaktioner. Mange DNAser (proteiner, der tygger DNA) og proteaser (proteiner, der skærer andre proteiner) har brug for magnesiumioner for at virke, så ved at fratage dem denne hovedingrediens, EDTA og EGTA, hjælper de med at reducere niveauet af protease eller af DNAse-aktivitet. De udelukker dem imidlertid ikke fuldstændigt, og nogle proteaser er ikke afhængige af magnesiumkofaktorer, så lysepuffere indeholder undertiden også stoffer kaldet proteasehæmmere, som binder til det og forhindrer det i at fungere korrekt.
Alkalisk lysis
Alkalisk lysis er en meget almindelig teknik til oprensning af plasmider fra bakterier. Denne metode indebærer anvendelse af tre løsninger. Den første indeholder glucose, tris-HCL-buffer, EDTA og RNAses. Glukose skaber en høj koncentration af opløste bakterier uden for, så de bliver let slap, hvilket letter lyseprocessen. EDTA og tris-HCL fungerer som tidligere beskrevet, mens RNAse vil tygge alt RNA inde i cellen for at få det ud af vejen. Den anden løsning udfører effektivt cellelyse. Den indeholder vaskemiddel SDS og NaOH, som hæver pH til 12 eller derover, denaturerer proteinerne inde i cellen og får DNA'et til at adskille sig i enkle filamenter. Den tredje opløsning indeholder kaliumacetat for at genoprette pH til et mere neutralt niveau, så plasmid-DNA-strengene kan komme sammen. I mellemtiden samles de denaturerede proteiner og udfældes, mens dodecylsulfationerne forbinder med kaliumionerne til dannelse af en uopløselig forbindelse, som også kan udfældes ud af opløsningen.